生もとについて言われていることの一例として，工業規模で製造した生もとと速醸もとを約二ヶ月にわたって，10℃に保存し，その間のエタノール濃度と酵母生菌数を測定した結果を示す(Fig.1)．
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Fig. 1. Time course of ethanol production and viability of
yeast in moto(seed mash) during the resting period. Ripened
moto was preserved at 10℃, and ethanol concentration(○) and
the number of surviving yeast cells(●) was determined for 9 weeks.
(A), Sokujo-moto(conventional procedure); (B), kimoto(traditional
procedure).
|
いずれの酒母においても指数的に生菌数の減少が認められたが，速醸もと中の酵母の生存率が9週間後には0.6％になったのに対し，生もと中の酵母の生存率は12.6％ときわめて高い値を示した．それと同時に，生もとにおいては菌体あたりのエタノールの生成速度の小さい傾向が観察され，発酵経過にも相違が認められた.6)
そこで，生もとの酵母と速醸もとの酵母の膜脂質の組成分析を行ったところ，脂肪酸組成に著しい違いのあることがわかった(Table 1)．
| Table
1. Fatty acid composition of lipids extracted from yeast grown in
sokujo-moto and kimoto. |
|
| Moto |
Lipid |
Fatty
acid composition(％) |
|
| 14:0 |
16:0 |
16:1 |
18:0 |
18:1 |
18:2 |
|
| Sokujo-moto |
PE |
NDa |
29.1 |
5.9 |
14.9 |
19.5 |
30.6 |
| PC |
ND |
23.4 |
tr. |
17.6 |
20.1 |
48.4 |
| PI |
ND |
32.9 |
4.0 |
18.2 |
17.0 |
27.9 |
| TG |
3.6 |
35.0 |
1.0 |
6.5 |
14.7 |
39.2 |
|
| Kimoto |
PE |
7.3 |
35.2 |
23.8 |
15.1 |
15.1 |
tr.b |
| PC |
ND |
29.5 |
12.3 |
32.7 |
19.9 |
5.5 |
| PI |
ND |
47.5 |
13.2 |
18.7 |
11.6 |
5.7 |
| TG |
ND |
55.5 |
2.2 |
11.8 |
21.0 |
5.8 |
|
Fatty acids are denoted by the number
of carbon atoms:number of unsaturated linkages. Abbreviations: PE,
phosphatidylethanolamine; PC, phosphatidylcholine; PI, phosphatidylinositol;
TG, triglyceride.
a Not
detected.
b Trace.
|
速醸もとで育成された酵母のリン脂質は，ホスファチジルコリン(PC)，ホスファチジルエタノールアミン(PE)，ホスファチジルイノシトール(PI)のいずれにおいても，リノール酸(18:2)の比率はおよそ30〜50％と高い値を示した．他方，生もとで育成された酵母の場合は，数％のリノール酸(18:2)含量を示し，パルミチン酸(16:0)，またはステアリン酸(18:0)が増大していた．また，単純脂質であるトリアシルグリセロール(TG)においても，その傾向は同様であった．
Saccharomyces cerevisiaeは，リノール酸(18:2)をほとんど合成しないので,7)酵母脂質中に見いだされたリノール酸(18:2)は，原料由来であることを示している．清酒醸造では，リノール酸(18:2)とパルミチン酸(16:0)が，原料に由来する主要な遊離脂肪酸として環境に存在し，酵母がこのような長鎖の脂肪酸を，菌体脂質として利用することはよく知られている.8)したがって，Table
1にみられた脂肪酸組成の違いは，環境の遊離脂肪酸組成を反映していると考えられた．
そこで，膨れ前(酵母が増殖の兆しを示す少し前で，液相の比重が最大になる頃)の酒母を採取し，液相及び固相表面に存在する遊離脂肪酸を，石油エーテル・エーテルで転溶して，脂肪酸組成を比較した(Table
2)．
| Table 2. Composition
of free fatty acids extracted from moto. |
|
| Solvent for extraction |
Moto |
Fatty
acid composition |
|
|
14:0 |
16:0 |
18:0 |
18:1 |
18:2 |
18:3 |
Total |
|
| Petroleum
ether:Ether (2:1) |
Kimoto |
(mg) |
0.11 |
2.06 |
0.06 |
0.05 |
0.09 |
ND |
2.47 |
|
(%) |
4.3 |
87.4 |
2.6 |
2.1 |
3.5 |
- |
|
| Sokujo-moto |
(mg) |
0.06 |
0.33 |
0.03 |
0.14 |
0.54 |
0.02 |
1.12 |
|
(%) |
5.4 |
30.1 |
2.5 |
12.9 |
47.8 |
1.4 |
|
|
| Chloroform:Methanol
(1:1) |
Kimoto |
(mg) |
0.23 |
3.45 |
0.27 |
1.16 |
2.25 |
0.07 |
7.43 |
|
(%) |
3.1 |
16.6 |
3.6 |
16.1 |
29.8 |
0.8 |
|
| Sokujo-moto |
(mg) |
0.17 |
3.12 |
0.17 |
0.81 |
3.1 |
0.10 |
6.47 |
|
(%) |
2.6 |
33.1 |
2.6 |
13.0 |
47.3 |
1.5 |
|
|
| Thirty grams of moto were lyophilized,
and lipids were extracted twice with 60 ml of solvent for 2 min.
Fatty acid fractions on a silica gel plate by TLC were extracted
with chloroform:methanol(1:1). |
その結果，速醸もとでは，リノール酸(18:2)が主要脂肪酸であるのに対し，生もとでは，リノール酸(18:2)の比率が著しく低下し，パルミチン酸(16:0)が大部分を占めることがわかった．生もとにおいても，クロロホルム・メタノールを用いて，米粒組織内部の遊離脂肪酸も抽出すると，リノール酸(18:2)が抽出されることから，酵母の増殖環境では，生もとと速醸もとの間に脂肪酸組成の大きな相違があると考えられる．
このような違いは，製造方法の違いによるものと考えられた．生もとでは，低温下に乳酸菌を増殖させた後，酵母を接種し培養する．蓄積された乳酸の酸性によって，細菌の増殖は抑制され，酵母は純粋培養される．他方，速醸もとは，人工的に必要な乳酸を加えて，乳酸菌の増殖工程を省略する．そこで，乳酸菌増殖の影響を見るために，米，米麹に水を加えて，57℃で糖化した無菌醪に，生もと乳酸菌であるLeuconostoc
mesenteroides，またはLactobacillus sakeを1/1000量接種し，15℃に1週間培養した．乳酸菌の増殖によって，石油エーテル・エーテルで転溶される遊離脂肪酸の大部分が，パルミチン酸(16:0)となっており，クロロホルム・メタノールで抽出される全遊離脂肪酸の組成と大きく異った(Table
3)．
| Table 3. Composition
of free fatty acids in moromi mash. |
|
| Solvent for extraction |
Inoculum |
Fatty
acid composition |
|
|
12:0 |
14:0 |
16:0 |
18:0 |
18:1 |
18:2 |
Total |
|
| Petroleum
ether:Ether (2:1) |
no |
(mg) |
ND |
0.039 |
0.594 |
0.049 |
0.206 |
0.345 |
1.233 |
|
(%) |
- |
3.2 |
48.2 |
4.0 |
16.6 |
28.0 |
|
| L74 |
(mg) |
ND |
0.067 |
2.145 |
0.485 |
0.074 |
0.065 |
2.848 |
|
(%) |
- |
2.4 |
75.3 |
17.0 |
2.6 |
2.3 |
|
| L5 |
(mg) |
ND |
0.082 |
2.511 |
0.418 |
0.086 |
0.069 |
3.171 |
|
(%) |
- |
2.6 |
79.2 |
13.2 |
2.7 |
2.2 |
|
|
| Chloroform:Methanol
(1:1) |
no |
(mg) |
0.127 |
0.064 |
5.681 |
0.477 |
1.515 |
5.272 |
13.767 |
|
(%) |
1.6 |
4.4 |
41.3 |
3.5 |
11.1 |
38.3 |
|
| L74 |
(mg) |
0.195 |
0.659 |
7.285 |
0.721 |
1.870 |
5.034 |
15.768 |
|
(%) |
1.2 |
4.2 |
46.2 |
4.6 |
11.9 |
32.0 |
|
| L5 |
(mg) |
0.205 |
0.740 |
8.348 |
0.817 |
2.155 |
5.948 |
17.177 |
|
(%) |
1.1 |
3.9 |
45.9 |
4.5 |
12.0 |
32.7 |
|
|
| Each moromi mash was prepared
by saccharizing a mixture composed of steamed rice(14 g), rice koji(6
g), and tap water(29 ml) at 57℃ for 14 h, and inoculated with one
loopful of Lactobacillus sake L5, Leuconostoc mesenteroides
L74. Cultures were incubated at 15℃ for 1 week. |
多価不飽和酸を合成できない乳酸菌が，リノール酸(18:2)を取り込むことは，リノール酸(18:2)を加えた麹汁培地に乳酸菌を培養して，その菌体脂肪酸を測定することにより確かめられた(Table
4)．
| Table 4. Effect of linoleic acid on
cellular fatty acid composition of Lactobacillus sake L5.
|
|
Temp.
(℃) |
Addition of
18:2 |
Fatty acid composition(％)
|
|
| 14:0 |
14:1 |
16:0 |
16:1 |
18:0 |
18:1 |
18:2 |
19-cya |
|
| 30 |
- |
0.6 |
NDb |
45.0 |
3.4 |
6.2 |
34.3 |
ND |
10.5 |
| + |
1.4 |
0.4 |
24.2 |
3.1 |
1.0 |
22.4 |
41.6 |
5.8 |
|
| 15 |
- |
0.7 |
ND |
31.6 |
6.6 |
2.8 |
54.7 |
ND |
3.5 |
| |
(16.8)c |
(720.6) |
(15.1) |
(66.2) |
(1214.6) |
|
|
|
| + |
1.5 |
0.5 |
12.0 |
3.2 |
1.2 |
12.4 |
96.2 |
ND |
| |
(35.9) |
(12.1) |
(276.3) |
(73.3) |
(27.6) |
(277.9) |
(1636.1) |
|
|
Strain L5 was inoculated 1:1000 from
fresh cultures of growth medium into 500 ml of koji extract(Brix
5) supplemented with 0.5 mM linoleic acid and/or 1％ peptone were
harvested by centrifugation at 180,000 x g for 20 min, followed
by washing twice in 500 ml of 0.85％ NaCl aq. and once in petroleum
ether-diethylether(1:1).
a cy denotes cyclopropane acid.
b Not detected.
c The values in parentheses indicate
the content of each fatty acid(μg/100mg dry weight). |
低温下に増殖した生もと乳酸菌の菌体脂肪酸からは，著量のリノール酸(18:2)が検出され，菌体脂肪酸総量は対照培養菌体とほとんど変わらないことから，リノール酸(18:2)が菌体構成に利用されていると考えられた．さらに，興味深いことに，リノール酸(18:2)はオレイン酸(18:1)と同様に，生もと乳酸菌に対する増殖促進効果を持ち，生もとにおいて特異的に増殖する要因のひとつと考えられた．
以上のことから，生もと酵母と速醸もと酵母の間には，生もと乳酸菌の増殖に起因する，脂肪酸組成の大きな違いのあることがわかったが，リン脂質組成にも著しい相違が認められた．清酒酵母の膜リン脂質の大部分はPCとPEから構成されていたが，生もと酵母ではPC/PE比が0.59であったのに対し，速醸もと酵母では1.59と，大きな相違を示しており，両者を明確に判別することが出来た．このような差異もまた，環境の脂肪酸組成の違いによることが，パルミチン酸(16:0)添加培養菌体とリノール酸(18:2)添加培養菌体のPC/PE比を比較することにより確かめられた(Fig.2)．
 |
Fig. 2. Time course of growth
and the PC/PE ratio of the yeast cells in liquid culture. Cultures
were incubated in the medium supplemented with 0.5 mM linoleic acid(○)
or palmitic acid(●). Growth was followed by measuring the optical
density(OD) at 660 nm.
|
リン脂質疎水領域の空隙が大きい二価不飽和酸の配位にしたがい，エタノールアミンに比べて大きな塩基であるコリンを持つPCを増大させることは，膜構造を安定したものにするために必要なのかもしれない．
|
(きもと)づくり」